采用大腸桿菌表達(dá)蛋白是現(xiàn)階段使用非常廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，我們一般將這種方法稱為原核表達(dá)。這個(gè)方法的使用范圍非常的廣泛，比如在蛋白純化、定位以及相關(guān)蛋白功能分析等。因?yàn)榇竽c桿菌易于控制和生長(zhǎng)，而且價(jià)格相對(duì)便宜，使得其使用極為廣泛。

　　大腸桿菌蛋白表達(dá)時(shí)，常常會(huì)使用載體(通常為質(zhì)粒)來(lái)表達(dá)目的蛋白。原核表達(dá)通常按照：獲得目的蛋白、構(gòu)建表達(dá)載體、插入目的基因、培養(yǎng)宿主菌、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)、蛋白分析，最后通過(guò)擴(kuò)增、純化等操作后，進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè);

　　其具體操作步驟如下：

　　1、獲得目的基因

　　獲得目的基因的方法主要有兩種，一種是PCR方法，一種是RT-PCR方法，另外一種是人工合成法。

　　PCR法：以含有目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，通過(guò)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從而獲得基因片段;

　　RT-PCR法：從細(xì)胞或組織中提取RNA，而后以RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，而后以逆轉(zhuǎn)錄為模板獲得目的基因;

　　人工合成法：通過(guò)檢測(cè)到的目的基因序列，合成重疊的單鏈寡合苷酸，而后通過(guò)重疊延伸PCR法拼接出全長(zhǎng);

　　2、構(gòu)建表達(dá)載體

　　使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，而后對(duì)酶切的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，從而獲得載體大片段，而后通過(guò)相關(guān)技術(shù)手段將目的基因連入載體;

　　3、質(zhì)粒構(gòu)建

　　將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，而后對(duì)相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行挑選，再然后通過(guò)裂解法提取質(zhì)粒，最后檢測(cè)目的基因的插入方向并論證其正確性;

　　4、誘導(dǎo)表達(dá)

　　對(duì)含有目的基因的菌體進(jìn)行培養(yǎng)，而后取部分液體與未誘導(dǎo)組進(jìn)行對(duì)照，培養(yǎng)完成后，離心后取上清液作為樣品;

　　大腸桿菌蛋白表達(dá)的注意事項(xiàng)有哪些?

　　1、在我們選擇表達(dá)載體時(shí)，一定要根據(jù)蛋白的最終應(yīng)用來(lái)進(jìn)行選擇;

　　2、在進(jìn)行外源DNA連接時(shí)，需要確保其轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)移過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)相互干擾的情況;

　　大腸桿菌蛋白表達(dá)作為現(xiàn)階段使用最為廣泛的原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)槠溥z傳背景清晰的優(yōu)勢(shì)，在蛋白表達(dá)上有著極大的優(yōu)勢(shì)。在進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)時(shí)，需要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)操作，這樣才能在更大程度上保證蛋白的表達(dá)。武漢普健生物專(zhuān)業(yè)為廣大用戶提供原核蛋白表達(dá)服務(wù)，如果您有相關(guān)需求，歡迎來(lái)電咨詢。