穩(wěn)定細胞株構(gòu)建的第一個步驟就是細胞轉(zhuǎn)染，這項實驗的原理大家都清楚，但是為什么一上手就會出現(xiàn)多種問題，在實驗第一步就栽了跟頭呢？

是細胞轉(zhuǎn)染方法不對頭？還是實驗過程中的某個因素影響了轉(zhuǎn)染效率？了解本文這11個注意事項，讓你的細胞轉(zhuǎn)染實驗順利通關(guān)！

所謂轉(zhuǎn)染，是指在真核細胞里導入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常選用的轉(zhuǎn)染方法包括物理介導法（如電穿孔法、顯微注射和基因槍等）、化學介導法（如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)介導法）、生物介導法（如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導轉(zhuǎn)染等）。上述方法中，實驗室最常用的方法當屬是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。針對不同屬性細胞系，選擇轉(zhuǎn)讓方式時要做足功課，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，比如準備不充分、轉(zhuǎn)染條件不佳；再比如細胞株本身的特性和活性、細胞污染，轉(zhuǎn)染的DNA/RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等，小編總結(jié)了這11個注意事項，一起來學習吧！

01血清條件下的細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染可以使用血清，前提是DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物形成時不含血清，否則會降低轉(zhuǎn)染效率（血清會影響復合物的形成）。

轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，如加血清則應在DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物形成后加入，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。

對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用專用轉(zhuǎn)染試劑。條件允許情況下，可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細胞兩遍，注意洗的時候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細胞，而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害，細胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細胞受影響就更大了，死亡細胞會增多。

02培養(yǎng)基中的抗生素（PS）

抗生素（如青霉素、鏈霉素等）是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。由于陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使得對真核細胞無毒的抗生素進入細胞，從而降低細胞活性，導致轉(zhuǎn)染效率降低。因此，應避免在轉(zhuǎn)染前細胞鋪板時和在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用抗生素，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。

03細胞狀態(tài)

眾所周知，細胞的生長狀態(tài)影響實驗結(jié)果，原代細胞和傳代次數(shù)多的細胞都不是最佳選擇，處于對數(shù)生長期的細胞生長狀態(tài)最好，最適合轉(zhuǎn)染。有文獻研究傳代不要超過17代，細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態(tài)最好，傳代過多細胞形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結(jié)果。

04細胞鋪板密度

用于轉(zhuǎn)染的最佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做。

05啟動子的選擇

獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。

06DNA量

高質(zhì)量的DNA對于進行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達，48小時mRNA表達最高；72h蛋白表達最高。

07瞬時/穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達

穩(wěn)定基因表達符合長期生產(chǎn)需求。整個實驗操作流程提供長期穩(wěn)定及規(guī)模可調(diào)的蛋白生產(chǎn)。與穩(wěn)定基因表達相比，瞬時表達（TGE）主要適用于短期內(nèi)制備重組蛋白，普健生物的瞬時表達使用懸浮細胞，能夠完成mL到100L的體積的蛋白表達，一般在10天內(nèi)即可快速轉(zhuǎn)染，無需質(zhì)粒DNA的遺傳性選擇。

08轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測

基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率。

可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。

09穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選

用載體中所含的選擇標志進行篩選是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系最常用的方法?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個不同的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染，兩個質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。

10蛋白表達和培養(yǎng)基的選擇

哺乳動物細胞系合成可溶的、翻譯后修飾的蛋白，比細菌，真菌或昆蟲細胞中表達的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時轉(zhuǎn)染細胞可以快速表達，迅速地合成小量蛋白。普健生物使用細胞系包括CHO，HEK293,CHO-S,CHO-K1等常用細胞系。普健生物提供克隆的HEK293，CHO-S，DG44和CHO-K1細胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細胞系。這些細胞也可用于無血清和限定化學成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細胞中進行。這些細胞易于生長到高密度并合成更多蛋白，使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。

11轉(zhuǎn)染效率的驗證

最有效的驗證方式必須是qPCR驗證。

熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標記（一般是GFP）還是非熒光標記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完全證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證最為準確。